Las estructuras de la ARN polimerasa del virus de la influenza A ofrecen información sobre la replicación del genoma viral

Nature volumen 573, páginas 287–290 (2019)Cite este artículo

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Los virus de la influenza A son responsables de epidemias estacionales y pueden surgir pandemias a partir de la transmisión de nuevos virus zoonóticos de la influenza A a los humanos1,2. Los virus de la influenza A contienen un genoma de ARN segmentado de sentido negativo, que es transcrito y replicado por la ARN polimerasa dependiente de ARN viral (FluPolA) compuesta por las subunidades PB1, PB2 y PA3,4,5. Aunque la estructura cristalina de alta resolución del FluPolA del virus de la influenza A de murciélago se ha informado previamente6, no hay estructuras completas disponibles para el FluPolA humano y aviar. Además, los mecanismos moleculares de la replicación del ARN viral genómico (ARNv), que se produce a través de un intermediario replicativo de ARN complementario (ARNc) y requiere la oligomerización de la polimerasa7,8,9,10, siguen siendo en gran medida desconocidos. Aquí, utilizando cristalografía y microscopía crioelectrónica, determinamos las estructuras de FluPolA de los virus de la influenza humana A/NT/60/1968 (H3N2) y de la influenza aviar A/pato/Fujian/01/2002 (H5N1) con una resolución de 3,0. –4,3 Å, en presencia o ausencia de un molde de ARNc o ARNv. En solución, FluPolA forma dímeros de heterotrímeros a través del dominio C-terminal de la subunidad PA, el subdominio pulgar de PB1 y el subdominio N1 de PB2. La estructura de microscopía crioelectrónica del FluPolA monomérico unido a la plantilla de ARNc revela un sitio de unión para el ARNc 3' en la interfaz del dímero. Utilizamos una combinación de ensayos celulares e in vitro para demostrar que la interfaz del dímero FluPolA es necesaria para la síntesis de ARNv durante la replicación del genoma viral. También mostramos que un nanocuerpo (un anticuerpo de dominio único) que interfiere con la dimerización de FluPolA inhibe la síntesis de ARNv y, en consecuencia, inhibe la replicación del virus en las células infectadas. Nuestro estudio proporciona estructuras de alta resolución de FluPolA médicamente relevante, así como información sobre los mecanismos de replicación del genoma de ARN viral. Además, nuestro trabajo identifica sitios en FluPolA que podrían ser objetivos en el desarrollo de medicamentos antivirales.

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Todos los datos están disponibles de los autores correspondientes y/o incluidos en el manuscrito o en la Información complementaria. Las coordenadas atómicas se han depositado en el PDB con los códigos de acceso 6QNW (H3N2 FluPolA), 6QPF (H5N1 FluPolA) y 6QPG (H3N2 FluPolA + Nb8205). Los mapas de densidad crio-EM se han depositado en el Banco de datos de microscopía electrónica con los códigos de acceso EMD-4661 (H3N2 FluPolA monomérico + cRNA + Nb8205), EMD-4663 y EMD-4664 (H3N2 FluPolA + cRNA dimérico), EMD-4666 (dimérico H3N2 FluPolA + cRNA + Nb8205), EMD-4660 (FluPolB monomérico + cRNA) y EMD-4986 (H3N2 FluPolA monomérico + vRNA + RNA caperuzado) con las coordenadas atómicas correspondientes depositadas en el PDB con números de acceso 6QX3, 6QX8, 6QXE, 6QWL y 6RR7, respectivamente.

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Agradecemos a GG Brownlee y F. Vreede por los plásmidos; I. Berger por el sistema MultiBac; S. Cusack por compartir y discutir datos no publicados sobre el sitio de unión del promotor 3'; K. Harlos y T. Walter por su ayuda con la cristalización; K. Dent y D. Clare por su asistencia crio-EM; GG Brownlee, D. Stuart y A. te Velthuis, así como a los miembros de los laboratorios Fodor y Grimes, por sus útiles comentarios y debates; e Instruct-ERIC, parte del Foro estratégico europeo sobre infraestructuras de investigación (ESFRI), Instruct-ULTRA (beca UE H2020 731005) y la Fundación de Investigación - Flandes (FWO) para apoyar el descubrimiento de nanocuerpos. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones del programa del Medical Research Council (MRC) MR/K000241/1 y MR/R009945/1 (a EF), Wellcome Investigator Award 200835/Z/16/Z (a JMG), becas MRC (a APW y ISM) y Wellcome Studentship 092931/Z/10/Z (a NH). Agradecemos a Diamond Light Source por el tiempo de emisión (propuestas MX10627, MX14744 y MX19946) y por el acceso y el apoyo de las instalaciones crio-EM en el Centro Nacional de Bioimagen Electrónica (eBIC) del Reino Unido (propuestas EM14856 y EM20233), financiado por Bienvenidos, MRC y BBSRC. Se proporcionaron más servicios de microscopía electrónica a través de las instalaciones de microscopía electrónica de OPIC, que fueron financiadas por un premio Wellcome JIF (060208/Z/00/Z) y respaldadas por una subvención para equipos de Wellcome (093305/Z/10/Z). La computación utilizó las instalaciones de Oxford Biomedical Research Computing (BMRC), un desarrollo conjunto entre el Wellcome Center for Human Genetics y el Big Data Institute, con el apoyo de Health Data Research UK y el NIHR Oxford Biomedical Research Centre. El apoyo financiero fue proporcionado por un premio Wellcome Trust Core (203141/Z/16/Z). Las opiniones expresadas son las del autor (es) y no necesariamente las del NHS, el NIHR o el Departamento de Salud. Parte de este trabajo fue financiado por la subvención de apoyo administrativo 203141/Z/16/Z de Wellcome.

Itziar Serna Martin

Dirección actual: Química cristalina y estructural, Centro Bijvoet de Investigación Biomolecular, Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad de Utrecht, Utrecht, Países Bajos

Narin Hengrung

Dirección actual: Instituto Francis Crick, Londres, Reino Unido

Estos autores contribuyeron igualmente: Haitian Fan, Alexander P. Walker, Loïc Carrique, Jeremy R. Keown

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Jonathan M. Grimes, Ervin Fodor

Escuela de Patología Sir William Dunn, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

Fan haitiano, Alexander P. Walker, Itziar Serna Martin, Jane Sharps, Narin Hengrung y Ervin Fodor

División de Biología Estructural, Centro Wellcome de Genética Humana, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

Loïc Carrique, Jeremy R. Keown, Itziar Serna Martin, Dimple Karia, Narin Hengrung y Jonathan M. Grimes

Centro VIB-VUB de Biología Estructural, VIB, Bruselas, Bélgica

Los Pardon

Biología Estructural Bruselas, Vrije Universiteit Brussel, Bruselas, Bélgica

Jan Steyaert

Fuente de luz de diamante, Didcot, Reino Unido

Jonathan Grimes

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HF, APW, LC, JRK, JMG y EF concibieron y diseñaron el estudio. HF, LC, JRK y NH llevaron a cabo la clonación de baculovirus recombinantes y la purificación de proteínas. HF y JRK realizaron cristalizaciones, recopilación y análisis de datos, construcción y refinamiento de modelos. LC y JRK recopilaron y procesaron datos de microscopía electrónica, y construyeron y refinaron modelos con la ayuda de DK e ISMAPW, realizaron ensayos funcionales y analizaron datos. J. Sharps realizó ensayos de dimerización en células de mamíferos y EF analizó los datos. EP y J. Steyaert diseñaron y generaron Nb8205 y Nb8210, y NH realizó la expresión y purificación de nanocuerpos. JMG y EF supervisaron los estudios estructurales y funcionales, respectivamente. HF, APW, LC, JRK, JMG y EF escribieron el manuscrito, con aportaciones de todos los coautores.

Correspondencia a Jonathan M. Grimes o Ervin Fodor.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nota del editor: Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Información de revisión por pares Nature agradece a Seth Darst, Achilleas Frangakis y Peng Gong por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

a, b, Vistas de la estructura de los heterotrímeros FluPolA H3N2 humano (a) y H5N1 aviar (b), coloreados según la subunidad. c – e, Estructuras de las subunidades PA (c), PB1 (d) y PB2 (e) del H3N2 FluPolA humano, coloreadas y etiquetadas por dominio. f, mapas de dominio de cada una de las subunidades de FluPolA H3N2. g – i, Los mapas de densidad electrónica 2D Fo - Fc de la interfaz del dímero FluPolA como se muestra en la Fig. 1c (g, vista estéreo) y la Fig. 1d (h, vista estéreo), así como el dímero FluPolA completo (i) , se muestran en malla gris (contorneados a 1,5σ, todos del modelo de estructura de H3N2 FluPolA).

a, análisis SEC-MALS de FluPolA H3N2 de tipo salvaje y mutante PA (352–356A) (n = 1 experimento). Las líneas suaves reflejan la señal UV relativa de SEC y las líneas de puntos indican la masa molecular estimada para cada cuadro. Tenga en cuenta que el heterotrímero FluPolA monomérico tiene una masa molecular aproximada de 255 kDa. b, Efecto de la mutación PA (352–356A) sobre la dimerización de FluPolA en células HEK293T. Los datos son media ± sem n = 3 transfecciones independientes. ANOVA unidireccional. P < 0,05 se considera significativo. c, Efecto de mutaciones diseñadas para desestabilizar los bucles PB2 y PA en la interfaz del dímero FluPolA sobre la actividad de FluPolA en un ensayo de reconstitución de RNP viral. Los datos son media ± sem n = 3 transfecciones independientes. ANOVA de dos vías. P < 0,05 se considera significativo. d, e, Efecto de la mutación PA (352–356A) en la replicación in vitro del cebador ApG por FluPolA en una plantilla de ARNv (d) y ARNc (e). f, Efecto de un mutante de polimerasa de sitio activo (PB1a) sobre la replicación in vitro del cebador ApG mediante FluPolA en una plantilla de ARNc. Los datos son media ± sem n = 4 reacciones independientes. g, Omitir UTP de la replicación in vitro del cebador ApG por parte de FluPolA en una plantilla de ARNc afecta la síntesis del ARNv de longitud completa de 15 nucleótidos, pero no del ARNv corto de 12 nucleótidos, lo que indica que el producto de 12 nucleótidos es derivado de la iniciación interna por el dinucleótido ApG en las posiciones 4 y 5 del molde de ARNc. La posición en la plantilla en la que se requiere UTP se indica en rojo. Datos representativos de n = 2 reacciones independientes. Para obtener datos de la fuente del gel, consulte la figura complementaria 2.

a, Micrografía representativa de partículas de heterotrímero FluPolA unidas a ARNc incrustadas en hielo vítreo. b, Promedios representativos de clases 2D. c, Curvas de correlación de capa de Fourier (FSC) para la reconstrucción 3D utilizando el refinamiento estándar en RELION, que indica una resolución general del mapa de 4,07 Å y el FSC de modelo a mapa. Se muestran curvas para mapas enmascarados con aleatorización de fase, desenmascarados, enmascarados y corregidos con aleatorización de fase. d, Una reconstrucción 3D, filtrada localmente y coloreada según la resolución local RELION. e, Distribución angular de proyecciones de partículas con el mapa crio-EM mostrado en gris. f, densidad Cryo-EM del bucle PA 352–356 en la interfaz del dímero. g, mapa Cryo-EM del dímero FluPolA unido a ARNc refinado sin simetría impuesta (C1), que revela una densidad adicional (verde) ubicada junto al extremo 3' del ARNc 5' cerca del canal de entrada de la plantilla. h, Vistas en primer plano que resaltan la densidad adicional en el mapa crio-EM (verde oscuro) con la cadena de ARNv 3' de la estructura FluPolB superpuesta51 (PDB 5MSG, verde claro) insertándose en el sitio activo de la polimerasa. La localización del ARNv 3' muestra que las bases están ubicadas en la densidad extra, frente a la densidad que corresponde al extremo 3' del ARNc 5'. Esto sugiere la presencia de una región dúplex de ARN promotor, como se observa en la estructura FluPolB unida a ARNv51. La densidad adicional es consistente con la presencia de un ARNc 3' en uno de los heterotrímeros del dímero FluPolA unido a ARNc, orientado hacia el sitio activo de la polimerasa.

a, SDS-PAGE de nanocuerpos purificados (n = 1 experimento). b, SEC analítica de FluPolA en complejo con nanocuerpos (n = 4 experimentos para Nb8205 y n = 2 experimentos o Nb8210, con resultados similares). c, Efecto de los nanocuerpos sobre la dimerización de FluPolA en células HEK293T. Los datos son media ± sem n = 4 transfecciones independientes. ANOVA unidireccional. P < 0,05 se considera significativo. Para obtener datos de la fuente del gel, consulte la figura complementaria 2. d, Estructura cristalina de H3N2 FluPolA en complejo con Nb8205. e, Vista cercana de las interacciones FluPolA-Nb8205. Los residuos involucrados en las interacciones de los enlaces de hidrógeno están etiquetados y los enlaces de hidrógeno se indican con líneas discontinuas. Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) están coloreadas individualmente y etiquetadas.

a, Micrografía representativa de FluPolA unido a ARNc en complejo con Nb8205, incrustado en hielo vítreo. b, Promedios representativos de clases 2D. c, curvas FSC para la reconstrucción 3D utilizando el refinamiento estándar de oro en RELION, que indica una resolución de mapa general de 3,79 Å y 4,15 Å para la forma FluPolA monomérica y dimérica, respectivamente, y el FSC de modelo a mapa. Se muestran curvas para mapas enmascarados con aleatorización de fase, desenmascarados, enmascarados y corregidos con aleatorización de fase. d, f, Las reconstrucciones 3D, filtradas localmente y coloreadas según la resolución local RELION, para la forma dimérica (d) y monomérica (f). e, g, Distribución angular de proyecciones de partículas para la forma dimérica (e) y monomérica (g), con el mapa crio-EM mostrado en gris. h, Dímero de heterotrímeros FluPolA unidos al promotor de ARNc y cuerpo rígido Nb8205 instalado en el mapa crio-EM del heterotrímero FluPolA dimérico unido a ARNc en complejo con Nb8205. i, mapa Cryo-EM del heterotrímero FluPolA unido a ARNc dimérico en complejo con Nb8205, que revela una densidad adicional (verde) ubicada junto al extremo 3' del ARNc 5' (como también se observa para el dímero FluPolA unido a ARNc; Datos ampliados Fig. 3g, h).

a, Micrografía representativa de partículas de heterotrímero FluPolB unidas a ARNc incrustadas en hielo vítreo. b, Promedios representativos de clases 2D. c, Una reconstrucción 3D, filtrada localmente y coloreada según la resolución local RELION. d, curvas FSC para la reconstrucción 3D utilizando el refinamiento estándar en RELION, lo que indica una resolución general del mapa de 4,18 Å y el FSC de modelo a mapa. Se muestran curvas para los mapas enmascarados con aleatorización de fase, desenmascarados, enmascarados y corregidos con aleatorización de fase. e, Distribución angular de proyecciones de partículas según el refinamiento no uniforme de cryoSPARC v.2.5. f, mapa Cryo-EM de FluPolB unido a ARNc. g, Comparación de la interfaz de dimerización y el sitio de unión de ARNc 3ʹ en H3N2 FluPolA (PDB 6QNW y 6QPG). h, el sitio de unión de ARNc 3' en FluPolA y FluPolB se superpone con el sitio de unión de ARNv 3' previamente identificado en la polimerasa de orthobunyavirus de La Crosse19 (PDB 5AMQ). Los sitios de unión de ARNv 3' en la superficie de la polimerasa en FluPolB (PDB 4WRT) y en el sitio activo de la polimerasa para FluPolB (PDB 5MSG) se muestran a modo de comparación6,51. i, La comparación de la estructura del FluPolA dimérico con el FluPolB monomérico (PDB 5MSG)51 revela un movimiento del bucle de cebado que sobresale del subdominio del pulgar de PB1 hacia el sitio activo de la polimerasa. Los residuos de PB1 resueltos más cercanos a la punta del bucle de cebado (residuos E638 y M656) se alejan de los residuos E637 y M655 correspondientes en FluPolB y el sitio activo de la polimerasa (indicado por el final del ARNv 3') en aproximadamente 7 Å.

a, Micrografía representativa de partículas de heterotrímero FluPolA unidas a ARNv incrustadas en hielo vítreo. b, Promedios representativos de clases 2D. c, curvas FSC para la reconstrucción 3D utilizando el refinamiento estándar de oro en RELION, que indica una resolución general del mapa de 3,01 Å y el FSC de modelo a mapa. Se muestran curvas para mapas enmascarados con aleatorización de fase, desenmascarados, enmascarados y corregidos con aleatorización de fase. d, Una reconstrucción 3D, filtrada localmente y coloreada según la resolución local RELION. e, Distribución angular de proyecciones de partículas con el mapa crio-EM mostrado en gris. f, mapa Cryo-EM del heterotrímero FluPolA unido a ARNv, que revela la presencia de un bucle de cebado completamente resuelto. g, Vistas en primer plano que resaltan el apilamiento del ARNv 3' mediante el bucle de cebado. h, Caricatura del papel de la dimerización de la polimerasa en la realineación de la plantilla durante el inicio de la replicación en una plantilla de ARNc. El emparejamiento de bases entre los ARNc 5' y 3' posiciona las bases 4 y 5 del ARNc 3' junto a los aspartatos catalíticos (residuos D445 y D446 de PB1) en el sitio activo para permitir el inicio de la replicación interna mediante la síntesis de un dinucleótido pppApG. . El bucle de cebado apila la plantilla de ARNc a través de P651 de PB1 (izquierda). La rotación del subdominio del pulgar de PB1 y el subdominio N1 de PB2 desencadenada por la dimerización de la polimerasa da como resultado un movimiento del bucle de cebado y un retroceso de la plantilla apilada (flechas). El retroceso también se ve facilitado por una interacción del residuo R46 de PB2 con el ARNc 3', que introduce una "torcedura" en la plantilla. El retroceso posiciona las bases 1 y 2 de la plantilla de ARNc frente al dinucleótido pppApG que permanece coordinado por los aspartatos catalíticos. El complejo de replicación resultante está listo para extender el dinucleótido pppApG incorporando el siguiente NTP entrante (derecha).

a, b, Efecto de Nb8205 en la replicación in vitro del cebador ApG mediante FluPolA en una plantilla de ARNv (a) y ARNc (b). Los datos son media ± sem n = 3 reacciones independientes. c, Omitir UTP de la replicación in vitro del cebador ApG por FluPolA en una plantilla de ARNc afecta la síntesis del ARNv de longitud completa de 15 nucleótidos, pero no del ARNv corto de 12 nucleótidos. La posición en la plantilla en la que se requiere UTP se indica en rojo. Datos representativos de n = 2 reacciones independientes. Para obtener datos de la fuente del gel, consulte la Figura complementaria 2. d, Estructura cristalina de H3N2 FluPolA con residuos de aminoácidos implicados en la adaptación del huésped de aves a mamíferos de los virus de la influenza A indicados52,53,54,55,56,57,58,59 ,60,61,62,63,64,65,66.

Este archivo contiene las Figuras complementarias 1-2. Figura complementaria 1 Similitud de secuencia de FluPol de diferentes géneros de virus de la influenza. ac, Alineación de secuencia de las subunidades de la polimerasa PA (a), PB1 (b) y PB2 (c) de A/NT/60/1968 (H3N2), A/duck/Fujian/01/2002 (H5N1), A/bat/ Guatemala/060/2010 (H17N10), B/Panamá/45/1990 y C/Johannesburgo/1/1966. Los residuos implicados en las interacciones de enlaces de hidrógeno en la interfaz del dímero FluPolA se indican en cian, los residuos implicados en el sitio de unión del promotor de ARNc 3' se indican en naranja y los residuos implicados en la unión de Nb8205 se muestran en rosa. La figura fue preparada con Espript 3.0 (http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi). Figura complementaria 2 Datos de origen (geles). a, Datos de origen para las principales cifras. b, Datos de origen para cifras de datos ampliados.

Estructura del FluPolA H3N2 humano unido a cRNA y Nb8205. Este video muestra un primer plano del sitio de unión del ARNc 3'.

Comparación de estructuras FluPolA monoméricas y diméricas en complejo con Nb8205. El vídeo muestra que la dimerización induce un movimiento de un haz helicoidal formado por los subdominios PB1 pulgar y PB2 N1. La dimerización conduce a la apertura del sitio de unión del ARNc 3', que es incompatible con la unión del ARNc 3'.

Comparación de la estructura de FluPolA dimérico con FluPolB monomérico (PDB: 5MSG). Comparación de la estructura de FluPolA dimérico con FluPolB monomérico (PDB: 5MSG).

Comparación de la estructura de FluPolA dimérico con FluPolA monomérico unido a ARNv. Este vídeo muestra el movimiento del bucle de cebado en el sitio activo de la polimerasa desencadenado por la dimerización.

Reimpresiones y permisos

Fan, H., Walker, AP, Carrique, L. et al. Las estructuras de la ARN polimerasa del virus de la influenza A ofrecen información sobre la replicación del genoma viral. Naturaleza 573, 287–290 (2019). https://doi.org/10.1038/s41586-019-1530-7

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Recibido: 12 de marzo de 2019

Aceptado: 07 de agosto de 2019

Publicado: 04 de septiembre de 2019

Fecha de emisión: 12 de septiembre de 2019

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-019-1530-7

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